در دهه‌ی گذشته، باکتری‌های استخراج زیستی به عنوان بازیگران اصلی فرآیند تصفیه، به دلیل اهمیت بالای آن‌ها در کاربرد استخراج فلز از مواد معدنی، مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. سیستم‌های تصفیه معمولا در محیط‌های شدید به این معنی که بسیار اسیدی هستند رخ میدهد (معمولا pH <3) و معمولاً حاوی غلظت بالایی از آهن، روی، مس و سایر فلزات سنگین هستند. به ویژه، در طول تصفیه ذرات معدنی، فلزات سنگین در محلول شستشو تجمع می‌یابند، همین امر حیات میکروارگانیسم‌ها را به خطر می‌اندازد چراکه آن‌ها درصد مشخصی از این مواد را تحمل میکنند و این مواد بالاتر از حدی سبب دناتوره کردن و تخریب پروتئین میشوند. با این حال، میکروارگانیسم‌های تصفیه‌گر می‌توانند با این محیط‌های نامهربان به خوبی کنار بیایند. تصفیه زیستی، یک فرایند پیچیده در رابطه با ارتباطات میکروب‌ها با عوامل محیطی و همچنین با خودشان می‌باشد. درحال حاضر، با ساخت گروه‌های میکروبی شامل اسیدوفیل‌ها (اسیددوست‌ها) و با کنترل شرایط تصفیه زیستی، مطالعاتی درمورد تسریع حل مواد معدنی انجام گرفته است. اینکه جوامع میکروبی چگونه به محیط خود و اعضای جامعه پاسخ می‌دهند سوالی‌ست که به دنبال جواب آن هستیم. رویکردهای ژنومی مستقل از کشت به طور قابل توجهی درک ما از بوم شناسی و تنوع جوامع میکروبی در محیط را ارتقا داده است. ژن‌های عملکردی و فن‌آوری‌های مولکولی مبتنی بر 16s rRNA برای تجزیه و تحلیل ساختار جامعه میکروبی توسعه یافته‌اند. پروتئومیکس برای توصیف بیان متفاوت پروتئین‌ها که توسط انواع مختلف سلول‌ها یا سلول‌هایی که تحت شرایط مختلف محیطی قرار دارند استفاده می‌شود که ابزاری مهم برای درک متقابل مواد معدنی میکروبی و توصیف تنوع زیستی میکروبی است. در فرآیندهای تصفیه، اکسیداسیون آهن و کاهش گوگرد توسط میکروارگانیسم‌های تصفیه‌گر زیستی عمدتا در فضای خارج سلولی رخ می‌دهد. در توافق با این مساله، چندین مطالعه پروتئومیکس مولکول‌های مرتبط با پروتئین موجود در لایه خارج سلولی را نشان می دهد که قادر به جمع‌آوری گوگرد و افزایش تصفیه سولفیدهای فلزی هستند. با معرفی روش میکرواری، دانشمندان میتوانستند تا با هزینه کمتر و با سرعت بیشتری تعداد زیادی از واریانت‌ها را بررسی کنند، اما میکرواری با مارکرهای انتخاب شده ساخته میشود و دستش برای یافتن واریانت‌های جدید بسته است. گرچه از این روش کماکان استفاده میشود اما با پیشرفت تکنولوژی روش‌های دیگری میتوانند جایگزین آن شوند.

در حال حاضر، فناوری‌هایی برای تعیین توالی در حال ظهور هستند که بصورت موازی تعداد زیادی از نمونه‌ها را توالی‌یابی میکند. (massively parallel sequencing (MPS مشکلات ذاتی روش‌های میکرواری با معرفی فن‌آوری‌های توالی‌یابی NGS، برطرف شد چراکه میتوان سطح بیشتری از ژنوم را مطالعه کرده و به دنبال واریانت‌های جدید بود که این امر به دلیل از قبل معین بودن مارکرهای میکرواری ممکن نیست. توالی‌یابی متاژنومیک با عملکرد بالا مبتنی بر DNA برای آشکار کردن جوامع میکروبی در دریا، خاک، لجن، روده انسان و حیوانات و ضایعات حیوانی استفاده شده است. سوالات مربوط به چگونگی پاسخ مجموعه‌های باکتریایی به اغتشاشات محیطی، با تجزیه و تحلیل mRNA حاصله بهتر از DNA ژنومی پاسخ داده می‌شود. RNA-Seq به شناسایی توالی‌هایی که با توالی ژنومی شناخته شده مطابقت دارند محدود نمی شود، بلکه به دلیل تفاوت در برش و جانشینی اگزون‌ها، میتوان انواع RNAهایی که ساخته میشوند را شناسایی کرد که این امر قدرت بیشتری برای مطالعه را در اختیارمان میگذارد. همچنین، رویکرد RNA-Seq دارای مزایای دیگری نسبت به فناوری میکرواری است، از جمله سیگنال پس‌زمینه کمتر، عدم وجود سقف برای تعیین کمیت که در نتیجه دامنه وسیع‌تری از سطوح بیان را میتوان بررسی کرد. همچنین این روش شناسایی ژن‌هایی زیاد رونویسی شده در یک جامعه را امکان‌پذیر می‌سازد، بنابراین میتوان پاسخ و عملکرد جامعه میکروبی به محیط را بهتر بررسی کرد.

• NGS راهکاری برای مطالعه میکروارگانیسم‌ها در محیط‌های زیست تصفیه‌گر

RNA-Seq یکی دیگر از کاربردهای تعیین توالی با راندمان بالا است که با نام توالی‌یابی کل رونوشت (whole transcriptom sequencing) نیز شناخته میشود. از فناوری‌های توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) برای تعیین پروفایل RNA از طریق توالی‌یابی cDNA، که تبدیل شده رونوشت‌های ریبونوکلئوتید به دئوکسی‌ریبونوکلوتید است، عمل می‌کند. روش RNA-seq میکروبی شامل چندین مرحله کلی است: نقطه شروع، استخراج نمونه‌های RNA بوده و به دنبال آن خارج‌سازی tRNA و rRNA، ساخت کتابخانه‌های cDNA، تعیین توالی بر روی یک پلت‌فرم MPS و درنهایت تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک هیستوگرام خوانش‌های cDNA است. این روش برای بررسی سلول‌های مخمر، انسانی و باکتریایی استفاده شده و حساسیت زیادی را برای ژنهای بیان شده در سطح پایین یا بسیار بالا نشان داده است، بنابراین دقت خوبی در کمی‌سازی رونویسی‌ها دارد. فناوری RNA-Seq اجازه می دهد تا اپرون‌ها و مناطق ترجمه نشده مشخص شود که به بهبود annotation (اینکه میتواند اطلاعات بیشتری درمورد توالی بدهد) و mapping (با کدام بخش ژنوم همتا یا به اصطلاح align میشوند) داده‌ها کمک میکند. این مورد قدرت این را می‌دهد تا رونویسی با تفکیک بیشتری در سطح تکنوکلئوتید مورد مطالعه قرار گرفته و همچنین مناطق پرتکرار ژنوم را نشان دهد.

• • NGS برای آنالیز ژنوم

برای درک بهتر اکولوژی در محیط طبیعی پیچیده، مطالعات بوم‌شناسی میکروبی در اکوسیستم‌های مدل ضروری است. محیط‌های مربوط به معدن اسید بعنوان یک اکوسیستم مدل مشخص شده است به دلیل اهمیت آنها در کاربرد در صنعت استخراج زیستی است. در سیستم‌های تصفیه‌گر، واکنش‌های بیوشیمیایی با مشارکت میکروارگانیسم‌ها، همراه با واکنش‌های شیمیایی، منجر به انحلال مواد معدنی سولفید و در نتیجه آزاد شدن فلز می شود. میکروبیولوژی محیط‌های تصفیه - از جمله فیزیولوژی رایج‌ترین اعضای جامعه، جانشینی میکروبی، رابطه پویای جمعیت با عوامل محیطی و تأثیر ترکیب جامعه بر عملکرد اکوسیستم - همواره هدف تحقیق در سیستم‌های زیست تصفیه‌گر بوده است. فناوری توالی‌یابی نسل جدید، با تجزیه و تحلیل جامع داده‌ها می‌تواند اطلاعات مربوط به ویژگی عمومی آن‌ها، به ویژه پتانسیل متابولیسم آن‌ها را بازیابی کند. از میان 157 ژنوم اسیدوفیل در پایگاه‌های داده قرار داده شدند، 20٪ به میکروارگانیسم های موجود در محیط‌های زیست تصفیه و استخراج مرتبط هستند. تحقیقات زیادی در مورد ژنومیک و متاژنومیک و ساخت مدل‌های متابولیکی انجام شده است. به طور کلی، به دلیل آنکه فناوری NGS توالی ژنومی بیشتری از باکتری‌های زیست تصفیه‌گر را تولید میکند و ژنوم حاوی تمام پتانسیل‌های میکروارگانیسم‌ها است، این روش فرصتی را برای پیش‌بینی مدل‌های پتانسیل ژنتیکی و متابولیکی باکتری‌های زیست تصفیه‌گر فراهم می‌کند و در نهایت درک ما از این میکروارگانیسم‌ها عمیق‌تر می‌کند.

• • NGS  برای شناسایی تنوع میکروبی حاضر در محیط‌های تصفیه معدن

میکروارگانیسم‌های زیست تصفیه‌گر که در محیط دشوار زندگی می‌کنند، در چرخه بیوشیمیایی عناصری مانند گوگرد، آهن و فلزات مختلف نقش دارند. آنها نقش یکپارچه و منحصر به فردی را در سیستم‌های تصفیه بازی کرده و ساختار، تعامل و پویایی آن‌ها در شرایط ترشح برای انحلال مواد معدنی و بازیابی فلزات بسیار مهم است. نشانگر مولکولی مناسبی که برای شناسایی و طبقه‌بندی سویه میکروبی استفاده می‌شود RNA ریبوزومی 16S است که بخشی از آن به دلیل ساختار بسیار محافظت شده آن است. به طورمثال، با تعیین توالی ژن 16S rRNA، تغییر جوامع میکروبی در معدن مس Dexing مورد بررسی قرار گرفته است، که Acidithiobacillus، Leptospirillum و Acidiferrobacter (اکسید کننده های S و Fe) سویه‌های غالب بودند، درحالیکه Acidiphilium (کاهنده S و Fe) در رسوبات بیشتر بود. این نشان داد که تغییر در ساختارهای زیرسیستم جامعه ممکن است نتیجه شرایط مختلف ژئوشیمیایی باشد. درنتیجه، فراوانی نسبی گونه‌های Acidithiobacillus اکسید کننده آهن به طور مداوم با تغییرغلظت Fe3 + و Cu2 + تغییر کرده و در سیستم‌های با غلظت فریک به فروس آهن کمتر و pH بالاتر از 3 غالب است. اما، اسیدیتوباسیلوس اکسیدکننده گوگرد گونه‌های غالب در چشمه‌های آب گرم با سولفید غنی بودند. به طور کلی، NGS درصورت داشتن عمق توالی کافی اجازه می‌دهد تا اطلاعات ژنومی و نقش‌های اکولوژیکی جمعیت با فراوانی کم را به دست آورد، چراکه NGS با صفاتی مثل توان عملیاتی بالا، اختصاصیت و مقدار نسبی، به راحتی تنوع میکروبی بیشتری را تشخیص می‌دهد.

• • NGS برای آنالیز بیان ژن در میکروارگانیسم‌های زیست تصفیه‌گر

میکروارگانیسم‌های بیولچینگ باید با انواع محیط پیچیده کنار بیایند به همین سبب ساختار و درنتیجه عملکرد جامعه در محیط‌های مختلف متفاوت است. در این محیط‌ها، میکروارگانیسم‌های زیست‌تصفیه‌گر به طورعمده مجبورند pH داخل سلولی تقریباً خنثی را حفظ کنند، از حمله مواد اسید نوکلئیک اضافی جلوگیری کرده، به کمبود دسترسی مواد اولیه و فرآیند استخراج حلال پاسخ دهند و در برابر یون‌های فلزی مقاومت کنند. دانستن چگونگی رشد و نمو آن‌ها در این محیط دشوار از اهمیت بالایی برخوردار است. تجزیه و تحلیل رونوشت‌ها به درک کامل فرایندهای بیولوژیکی در میکروارگانیسم‌های زیست تصفیه‌گر، مانند توسعه و تکامل سازگار و پاسخ استرس کمک می‌کند. برخلاف ژنوم‌، رونوشت‌ها با رشد، شرایط فیزیولوژیکی و محیط خارجی به صورت پویا تغییر می‌کند. فناوری‌های تعیین توالی mRNA با توان بالا که RNA-seq نامیده می‌شوند می‌توانند هم برای mapping و هم برای تعیین مقدار رونویسی باشند و بازدهی بالایی را در تعیین میزان تغییر بیان هر رونوشت در شرایط مختلف نشان بدهد. لازم به ذکر است که این روش هم‌اکنون درحال جایگزین شدن با میکرواری است. به طور مثال، با کمک این روش تحلیل، درک ما از نقش L. ferriphilumT در استخراج معادن اسیدی، فرآیندهای تصفیه زیستی و بهینه‌سازی شرایط تصفیه برای استخراج فلز را افزایش یافته است. برای شناسایی نحوه زندگی این میکروارگانیسم، از طریق توالی رونوشت RNA و پروتئومیکس، ژن‌های رشد با استفاده از ماده اولیه‌ی Fe2 + شناسایی شدند. دانشمندان، بر روی خوشه‌ای که قبلاً برای تثبیت نیتروژن کشف نشده بود، فرآیندهای متابولیکی از جمله صرفه‌جویی در انرژی، تثبیت دی‌اکسیدکربن، هموستاز pH، مقاومت در برابر فلز، مدیریت استرس اکسیداتیو ، ارتباط سلول‌ها با یکدیگر و تشکیل بیوفیلم از طریق تجزیه و تحلیل رونوشت mRNA را بررسی کردند.

• چالش‌ها و چشم‌اندازها

اگرچه قدرت توالی‌یابی با عملکرد بالا به عنوان ابزاری برای شناسایی گونه‌های میکروبی زیست تصفیه‌گر و پروفایل بیان ژن نشان داده شده است، اما، هنوز با چالش‌های مختلفی روبرو است. اول، به دلیل بایاس و سوگیری که در تهیه کتابخانه cDNA برای مطالعات NGS وجود دارد، این داده‌ها نمیتواند ترکیب واقعی نمونه را منعکس کند چراکه بعضی از میکروارگانیسم‌ها حذف میشوند. چندین مرحله دستکاری در طول تولید کتابخانه cDNA شامل رونویسی معکوس، لیگیشن و آغاز رونوشت تصادفی سبب این چالش میشود. در حین رونویسی معکوس، cDNA رشته اول و همچنین رشته دوم گاهی توسط آنزیم‌ها سنتز می‌شوند، به همین دلیل، اتصال ناکارآمد یا کارآمد RNA-RNA یا RNA-DNA در برخی توالی‌ها، همراه با استفاده از پرایمرهای تصادفی، ممکن است بایاس‌ها و نتایج مختلفی ایجاد کند. دوم، RNA-Seq با چالش‌های انفورماتیکی ناشی از مقدار زیاد داده روبرو است. این داده‌ها باید برای بازسازی رونوشت کامل، تجزیه و تحلیل واریانت‌های مختلف و حتی کمی کردن میزان بیان برای هر نسخه و ژن پردازش شوند که با کمک انواع ابزارهای بیوانفورماتیک و سطح قابل توجهی از مهارت برنامه نویسی انجام میشود. بنابراین ، تجزیه و تحلیل مجموعه داده‌های بزرگ تولید شده توسط NGS یک چالش است. سوم، به منظور تأمین نیازهای توالی‌یابی با توان بالا، DNA یا RNA استخراج شده باید غلظت نسبتاً زیادی داشته باشد و این نشان می دهد که تجزیه و تحلیل ژنتیکی بر اساس NGS ممکن است به دلیل مقدار پایینی از برخی نمونه‌های بیولوژیکی محدود باشد و از این نمونه‌ها در محاسبات استفاده نشود چراکه شناسایی نمیشوند. در آخر، برای عمق توالی بیشتر برای پوشش (coverage) کافی، هزینه‌ها بیشتر میشوند. اما، همانطور که فناوری تعیین توالی به سرعت توسعه می‌یابد، هزینه آن کاهش یافته و میتواند در آینده جایگاه میکرواری که روش ارجح‌تری برای مطالعه جوامع میکروبی می‌باشد را بدست آورد.