چکیده:

آزمایش‌های تشخیصی و غربالگری‌های متعددی پیش از تولد نوزاد و برای نظارت بر سلامتی مادر و جنین انجام می‌شوند. در کشورهای توسعه یافته، آزمایش‌های متنوعی در دوران بارداری الزامی و در دسترس هستند. این بررسی‌ها به تازگی فراگیر شده‌اند و عمر چندانی از ظهور آن‌ها نمی‌گذرد. ابتدا این آزمون‌ها منحصراً به صورت تهاجمی و سنتی صورت می‌گرفتند. آزمایش‌های تشخیصی تهاجمی، به این معناست که برای نمونه برداری از خون مادر که روشی غیر تهاجمی است استفاده نمی‌کنند بلکه برای مثال از مقدار کمی مایع آمنیوتیک در آمنیوسنتز و نمونه کوچکی از زائده‌های انگشتی بافت جفت در CSV، استفاده می‌کنند. روش‌های تهاجمی ممکن است آسیب به نوزاد و حتی سقط جنین غیرعمدی را در پی داشته باشند لذا توسعه­ی روش‌های آزمایش غیرتهاجمی بسیار مهم است.

 

تست های غیر تهاجمی پیش از تولد NIPT

 

در سال 1959، زیپورسکی و همکارانش متوجه شدند که سلول‌های سالم جنینی در پلاسمای خون مادر نیز حضور دارند. آزمایش تشخیص پیش از تولد به روش غیر تهاجمی با سنجش (Cell Free fetal DNA) از خون مادر انجام می‌شود. خون مادر شامل سلول‌های مادر و سلول‌های جنینی است. این سلول‌ها محتوای DNA خود را وارد گردش خون مادری می­کنند. اجزای سلولی جنین مانند  DNA و RNA  و پروتئین در خون مادر باردار حضور دارند و می‌توانند به عنوان نشانگر در مطالعات تشخیصی به کارگرفته شوند. گرچه مقدار سلول جنینی موجود در نمونه­ی خون مادر باردار غلظت کمی دارد اما شناسایی دی ان ای سلولی (آزاد) غیر وابسته­ی جنینی در پلاسمای مادر سبب به‌وجود آمدن روش‌های نوین تشخیصی با رویکرد غیرتهاجمی شد. دی ان ای جنینی قطعات کوتاه‌تری دارد؛ و عموماً پراکندگی این قطعات کوتاه‌تر از 150 جفت باز است. غلظت این قطعات نسبت به ژنوم مادری بسته به مدت زمان بارداری مادر بین 7.8 تا 13 درصد متغیر است. معمولاً پس از هفته­ی دهم بارداری می‌توان این شیوه را برای تشخیص اختلالات در تعداد کروموزوم‌ها (= aneuploidy تعداد کروموزوم بیشتر یا کمتر از تعداد طبیعی دارند) به کار برد. البته این دی ان ای جنینی پس از 24 ساعت از تولد نوزاد کامل از خون مادر پاک خواهد شد. اضافه­وزن و چاق بودن مادر در دقت این روش مؤثر است. مادران دارای اضافه­وزن غلظت کمتری از این دی ان ای جنینی را در خون خود دارند. در بافت های چربی فرایندهایی رخ می‌دهند که سبب فراهم شدن دی ان ای آزاد مادری بیشتری می‌شوند در دو مادر سنگین وزن و سبک وزن مقدار دی ان ای آزاد جنینی  تقریبا برابر است همین موضوع سبب کاهش غلظت دی ان ای آزاد جنینی شده به طوری که ممکن است درصورت اضافه وزن مادر و چاقی او نمونه­ی خونی او اطلاعات مناسبی را در اختیار ما نگذارد. از دیگر اطلاعات سودمند این نمونه‌ها وجود همبستگی مثبت بین پروتئین‌های  PAPP-A و  PIGF و کاهش بخش‌های جنینی در خون مادر باشند. به این معنی که چنانچه نسبت دی ان ای جنینی در خون مادری کم باشد می تواند نشانگری برای قرار گرفتن مادر در گروه پرخطر قلمداد شود.

با  توالی یابی قطعات مختلف دی ان ای آزاد جنینی و هم ترازی آن‌ها با توالی کامل ژنوم می‌توان درصدی از کروموزوم‌های مختلف را شناسایی و مقایسه کرد و امکان تشخیص برخی بیماری‌های ناشی از تغییرات درون کروموزومی را هم فراهم می‌کند. با این حال این روش همچنان دقت قابل قبولی برای شناسایی سندرم‌های مختلف ناشی از حذف در مقیاس کروموزومی (مانند سندرم پرادرویلی/انجلمن) ندارد. این روش توسط کالج آمریکایی متخصصین زنان و زایمان به عنوان آزمونی معمول برای شناسایی جهش‌های حذف در سطح زیرکروموزومی پیشنهاد نمی‌شود.

گرچه این روش در شناسایی اختلالات تعداد کروموزوم‌ها به طور گسترده استفاده می‌شود اما اخیراً کارکردهای محدودی در شناسایی اختلالات مونوژنیک (به دلیل تغییر در یک ژن به وجود می‌آیند) نیز بیان شده‌اند. در این روش خاص غیرتهاجمی تشخیص زودهنگام بیماری‌های مونوژنیک، دی ان ای آزاد مادری مانع تعیین مستقیم الل های به ارث رسیده از مادر می‌شوند. اگر همزمان با این روش غیر تهاجمی(cffDNA NIPT )، هاپلوتایپینگ برای هر دو والد انجام شود شناسایی بیماری‌های تک‌ژنی نیز به صورت غیرتهاجمی مقدور خواهد بود.(هاپلوتیپ گروهی از الل هاست که به صورت همزمان از یک والد به ارث می‌رسند.)

روش تشخیصی غیر تهاجمی بر مبنای دی ان ای آزاد جنینی  که ساده‌تر و بدون درد است و از خطر سقط جنین ناشی از آزمایش‌های تهاجمی (آمنیوسنتز و سی اس وی) جلوگیری می‌کند به سرعت فراگیر شده است؛ اما از یک سو نمونه‌هایی وجود دارند که نمی‌توان به طور قطعی با این آزمایش در مورد آن‌ها نظر داد. با وجود انتقاداتی که به این روش وارد است اما در مورد اختلالات تعداد کروموزوم‌ها دقت بسیار بالایی دارد. (جدول-1)

کالج آمریکایی ژنتیک پزشکی و ژنومیک(ACMG) پیشنهاد می‌کند این روش می‌تواند جایگزین مناسبی در تشخیص بیماری‌های Patau، Edwards و سندرم داون باشد. با وجود این شیوه‌نامهی جدید (ACMG) باید به خاطر داشت که این آزمایش غیر تهاجمی، یک آزمون تشخیصی است که باید توسط روش‌های تهاجمی مورد تأیید قرار بگیرند. و روش‌های تصویربرداری فراصوت همچنان جزء مهمی از مراقبت‌های دوران بارداری است.

اختصاصیت تست های NIPT
اختصاصیت تست های NIPT

از طرفی به نظر می‌رسد، استفاده­ی بیشتر از روش‌های غیرتهاجمی و کاسته شدن از به کارگیری رویکرد تهاجمی باعث کاهش مهارت در انجام بی خطر روش های تهاجمی شده و از این رو مخاطرات این روش ها را افرایش داده است. لذا تربیت افراد توانمند در حوزه ی تست‌های پیش از تولد بسیار ضروری است.

 

رویکرد وابسته به سلول:

پس از سال‌ها محققان توانستند راهی پیدا کنند که سلول‌های مادری و جنینی را از یکدیگر جدا کرده و مطالعه­ی سلول‌ها به صورت غیرتهاجمی می‌تواند افزایش دقت و رفع محدودیت‌های روش پیشین را در پی داشته باشد.

در این نوع از مطالعه سلول‌های گلبول قرمز هسته دار جنینی و تروفوبلاست مورد توجه هستند. البته چون اختصاصیت مارکر ها برای گلبول های قرمز هسته دار و غلظت کم آن ها عموما از تروفوبلاست ها استفاده می شود. برای جداسازی سلول‌های از فناوری نانو و میکروفلوییدییک و از آنتی بادی‌ها استفاده می‌کنند. سطحی (چیپ) را با آنتی بادی‌های سطح سلول جنینی (در این مثال گلبول قرمز هسته دار) پوشانده‌اند لذا پس ازاتصال سلول‌های جنینی به این سطح سلول‌های مادری و جنینی از هم جدا می‌شوند.

مطالعه­ی مبتنی بر سلول در سلول‌های جنینی فرصت شناسایی اختلالات  در سطح تعداد (copy number) تکرار را فراهم می‌کند و دقیق‌تر از روش غیرتهاجمی مذکور است.

استفاده از ابزارهای محاسباتی و بهبود در آنالیزهای آماری به محققان کمک می‌کنند که بدون تغییرات و هزینه‌های سنگین در آزمایشگاه، بتوان نتایج دقیق‌تری را به دست آورد لذا مطالعات حوزه­ی زیست شناسی محاسباتی می‌توانند کمک شایان توجهی به مطالعات این حوزه باشند.

تکنیک های جداکننده سلول های جنین در NIPT

 

 

بیوانفورماتیک:

برای تولید داده های ژنتیکی مربوط به تست NIPT در حال حاضر از دو روند توالی یابی استفاده می شود، اولی توالی یابی کل ژنوم و دومی توالی یابی هدفمند نواحی خاصی از ژنوم می باشد. در طی مراحل آنالیز داده های NGS حاصل شده ابزارهای بیوانفورماتیکی نقش اساسی را بازی می کنند( مثلا در تولید داده ها، هم ترازی آن ها و تشخیص واریانت های ژنتیکی).  آنالیزهای بیوانفورماتیکی پایین دست مربوط به cfDNA نیاز به الگوریتم های بیوانفورماتیکی دارد که اغلب برای تشخیص عدم تعادل در تعداد آلل ها، نمایش نواحی ژنتیکی، توزیع مربوط به طول خوانش ها و یا ترکیبی از این ها می باشد. همچنین با استفاده از روش های محاسباتی بیوانفورماتیکی می تواند به صورت محسوسی دقت و اختصاصیت تست های ژنتیکی را بدون نیاز به تجهیزات و کار آزمایشگاهی افزایش داد. آنالیزهای بیوانفورماتیکی غالبا شامل دو گام متصل به هم هستند: تشخیص واریانت های ساختاری و محاسبه ی نسبت ژنوم مربوط به جنین در ترکیب ژنومی که اصطلاحا کسر جنینی می گوییم. روش های رایج بر اساس فراوانی تکه های DNA مربوط به کروموزم تاثیر یافته است. روش استاندارد Z-score می تواند توسط اتخاب برخی کروموزوم ها به عنوان مرجع بهبود یابد و حذف تکه های طولانی خوانش که غالبا مربوط به ژنوم مادر می باشد از گام های بیوانفورماتیکی می باشد. همچنین حذف بایاس های مربوط به آزمایشگاه در جهت رسیدن به توزیع یکنواخت از دیگر گام ها می باشند. همچنین دسته ی جدیدی از روش ها وجود دارند که بر مبنای تشخیص تغییرات ساختاری بر مبنای  انحرافات توزیع طول تکه ها می باشد. همچنین روش های مبتنی بر طول و شمارش تعداد می توانند برای تفکیک بهتر بین نمونه های euploid و aneuploidy استفاده شده و مثبت کاذب های روش را کاهش دهند. روش های مبتنی بر SNP که می تواند منبع هر قطعه ژنوم را بر اساس ژنوتیپ های والدین مشخص کنند می توانند باعث انقلاب در این حوزه شوند.

روش بیوانفورماتیکی تست NIPT

 

 

اپی‌ژنتیک :

متیلاسیون دی ان ای از عوامل اساسی تنظیم و توقف عملکرد و بیان ژن‌های مختلف در جنین است. الگوی متیلاسیون و تاثیرات آن در بیان ژن در سلول‌های مختلف، با هم متفاوت هستند درنتیجه مطالعه­ی آن‌ها در سلول‌های مختلف می‌توانند منشأ اولیه­ی قطعات دی ان ای آزاد (cffDNA) را مشخص کنند. این روش در شناسایی تریزیومی 21 حساسیت و مرتبط بودن (specificity ) 100 درصد را نشان داده است. برتری اصلی مطالعات بر مبنای اپی ژنتیک، متد خاص این روش‌ها و استفاده از تجهیزاتی است که معمولاً در همه­ی آزمایشگاه‌های تشخیص ژنتیکی یافت می‌شوند به  NGS وابسته نیستند و انجام آن‌ها ساده‌تر و کم‌هزینه‌تر است.

نتیجه گیری و جمع بندی:

در پی مروری بر تازه‌های مطالعات انجام شده متوجه شدیم روش‌های متنوع تشخیصی وجود دارند اما انتخاب روش مناسب وابسته به شرایط مورد بررسی است. گرچه روش غیرتهاجمی کم هزینه‌تر و ساده‌تر است اما این روش‌ها نمی‌توانند به به طور کامل جانشین روش‌های تهاجمی باشند.